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QL-902在博來霉素誘導肺纖維化大鼠分析的使用

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-09-05 11:30【

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化( idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是指慢性、進行性、原因不明的肺間 質(zhì)性纖維化病變,其發(fā)病率為 10~15 人/10 萬人,呈 明顯增長趨勢,缺乏有效的治療手段、預后差。 迄今多項研究表明,Wnt/β-catenin 信號通路對組織系 統(tǒng)的生理、病理起著至關重要的作用,包括胚胎形成、 細胞增殖、細胞分化、血管生成及癌癥形成等。



1 實驗材料

1.1 動物

清潔級雄性 Wistar 大鼠 120 只,體質(zhì)量(200± 20)g,購自北京維通利華動物公司,動物許可證號 SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方 醫(yī)院實驗中心清潔級動物房。



1.2 藥物

肺纖方(黃芪 15 g,紅景天 15 g,冬蟲夏草 3 g, 炙麻黃 6 g,水蛭 5 g,白果 10 g,瓜蔞 20 g,甘遂 2 g, 海蛤殼 30 g),飲片由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院中藥 房提供,常規(guī)煎制,按每 100 g 體質(zhì)量給藥 1 mL 的 標準制備藥液。注射用博來霉素,浙江海正藥業(yè)股份 有限公司,15 mg/支,批號 16037911;醋酸潑尼松片, 天津力生制藥股份有限公司,5 mg/片,批號 1703035。



1.3 主要試劑與儀器

TRNzol 總 RNA 提取試劑,天根生化科技有限公 司,批號 DP405-02;RIPA 總蛋白提取試劑盒,美國 Sigma 公司,批號 Cat No.R0278;PMSF,美國 Sigma 公司,批號 Cat No. PMSF-RO;GAPDH 鼠單抗,天 津銳爾康生物科技有限公司,批號 Cat No.REK0005; 抗 wnt3a 抗體,美國 Thermo 公司,批號 Cat PA5-44946;抗 β-catenin 抗體,美國 CST 公司,批 號 Cat 8480;抗 WIF1 抗體,美國 Abcam 公司,批號 Cat ab155101;ECL,德國 Millipore 公司,批號 Cat No.WBKLS0500。超聲粉碎機(浙江三門超聲波儀器 廠),全自動顯微攝像系統(tǒng)(日本 Olympus 公司),渦 旋振蕩儀(型號 QL-902,海門市其林貝爾儀器制造有限公司),離心機(美國 Eppendorf 公司),分光光度計、酶標儀、電泳儀、轉膜儀(美國 Thermo 公司), 凝膠成像系統(tǒng)(型號 Tanon 1600,上海天能科技有限 公司),熒光定量 PCR 儀(型號 ABI7500,Applied Biosystems)。



2 實驗方法

實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng) 7 d 后,按隨機數(shù)字表分為假 手術組、模型組、潑尼松組和肺纖方高、中、低劑量 組,每組 20 只。采用博來霉素氣管插管復制肺纖維化模型。 大鼠腹腔注射 1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg 體質(zhì)量)麻 醉,仰臥位固定于手術臺上,經(jīng)氣管插入 18 號大鼠 導管。假手術組一次性氣管內(nèi)注入生理鹽水 1 mL/kg 體質(zhì)量,其余組以 3 mg/kg 注入博來霉素,隨即注入 空氣 0.3 mL,完畢后立即將大鼠直立、旋轉,清醒后 正常攝食飲水。大鼠造模次日開始常規(guī)灌胃給藥,每日 1 次。按 1 mL/100 g 體質(zhì)量給藥標準配制藥液。肺纖方高、中、 低劑量組給藥劑量依次為 19.8、9.9、4.95 g/kg 體質(zhì)量, 分別為成人臨床用藥的 2、1、0.5 倍,每周稱重,根 據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量;潑尼松組給予潑尼松藥液 4.2 mg/kg;模型組和假手術組給予等體積生理鹽水。 給藥至取材前 1 d。取大鼠肺組織 100 mg,裂解,離心,收集上清液, 提取組織總蛋白。待檢測蛋白樣品上樣 10 μg/孔;蛋 白電泳;轉膜至 0.45 μm 孔徑的 NC 膜,轉膜 1 h;封 閉;抗體孵育;洗膜;使用 ECL 發(fā)光試劑盒檢測肺 組織 wnt3a、β-catenin、WIF1 的蛋白表達。其中 wnt3a 稀釋比例為 1∶1000,β-catenin 稀釋比例為 1∶1000, WIF1 稀釋比例為 1∶2000,GAPDH 稀釋比例為 1∶ 10 000。使用 Image J 軟件對目的條帶行灰度分析, 計算目的蛋白相對表達量(目的蛋白灰度值/ GAPDH 灰度值)。



3 討論

海門市其林貝爾通過分析得出IPF是慢性,進行性和病因不明的間質(zhì)性肺疾病,治療效果欠佳。目前尚無特異性的治療藥物,糖皮質(zhì)激素主要用于肺纖維化急性加重期;吡非尼酮和尼達尼布已經(jīng)被批準用于治療肺纖維化。






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