骨關(guān)節(jié)炎( OA) 屬于中醫(yī)學(xué)痹證的范疇，好發(fā)于 老年人，以軟骨退變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生、細胞外基 質(zhì)( ECM) 代謝失調(diào)為主要的病理特征，軟骨變性是 OA 的最基本病理改變，臨床上表現(xiàn)為關(guān)節(jié)的疼痛、 僵硬、肥大及功能活動受限等 。臨床上應(yīng)用補腎 益肝活血方治療 OA 療效顯著，取得良好臨床效果， 并通過實驗探討了該方對軟骨細胞凋亡、骨髓基質(zhì) 細胞( BMSCs) 分化的影響，發(fā)現(xiàn)補腎益肝活血方有 抑制軟骨細胞凋亡的作用，其含藥血清能有效誘導(dǎo) BMSCs 成軟骨細胞分化，其作用機制很可能與細胞 外信號調(diào)節(jié)激 酶 ( EＲK) 和絲裂原活化蛋白激酶( MAPKs) 存在相關(guān)聯(lián)系。本研究旨在分析補腎益 肝活血方對 OA EＲK/p38MAPKs 信號通路產(chǎn)生的 影響，探究 OA 發(fā)生機制及 OA 治療中的機制。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料

1. 1. 1 實驗動物

選取健康的、成年 SPF 級雌性 SD 大鼠，重量 185 ～ 230 g，實驗用動物全部由南京 中醫(yī)藥大學(xué)研究所提供。為了使這些大鼠適應(yīng)周圍 環(huán)境，納入本實驗的所有 SD 大鼠均于實驗前 1 w 放 置在實驗室內(nèi)，飼養(yǎng)員進行常規(guī)的分籠飼養(yǎng)。實驗 室基本指標(biāo): 保持自然光照，良好的通風(fēng)，室內(nèi)溫度 要求控制在 18. 5～23. 0℃，濕度控制在 40% ～ 70%。 實驗研究期間，所有大鼠進食標(biāo)準(zhǔn)顆粒詞料，并可以 自由地飲用自來水，術(shù)前 8 h 禁食水。

1. 1. 2 主要試劑、儀器與藥品

胎牛血清( FBS，Gibco 公司) ; DMEM 低糖培養(yǎng)基( Hyclone 公司) ; 雙抗混合液( 100 U/ml 青霉素、100 μg /ml 鏈霉素) ，10%胰 蛋白酶、0. 2%Ⅱ型膠原酶( Sigma 公司) ; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 ( Fermentas 公司) ; 引物合成( 上海生工生物工程公司) ; 磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶 p38 抗體( Anti-pp38α，Thr180/Tyr182) 一抗( Millipore 公司) ; p38 一抗 ( Millipore 公司) 。二氧化碳培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微 鏡、流式細胞儀、酶標(biāo)儀、濾器、無菌操作臺和掌上迷你離心機。補腎益肝活血方由骨碎補 15 g、丹參10 g、沒 藥 10 g 及懷牛膝 10 g 組成，實驗所用藥物由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬省中西結(jié)合醫(yī)院藥劑科提供。

1. 2 實驗動物分組

40 只雌性 SD 大鼠隨機分為 4 組，即對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每 組各 10 只。

1. 3 補腎益肝活血方含藥血清的制備

根據(jù)人和 動物間按體表面積折算的等效劑量比率表換算，給 藥組給予補腎益肝活血方 3. 2 g /( kg·d) 灌胃，對 照組則給予等量的生理鹽水灌胃。各組每 12 h 灌 胃給藥 1 次，連續(xù)灌胃 5 d。并在最后一次灌胃前禁 食，末次灌藥 3 h 后，麻醉 SD 大鼠，行腹主動脈采 血，靜置于溫度預(yù)調(diào)在 4℃ 的冰箱 4 h 后，離心機設(shè) 置 2 500 r/min 的轉(zhuǎn)速，離心 25 min，分離離心所得 血清，將同組實驗動物分離所得到的血清予以混合， 并在 56℃ 水浴箱內(nèi)，滅活 30 min，抽濾、除菌后分 裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?br />
2 結(jié) 果

體外分離培 養(yǎng)的原代軟骨細胞外觀近似圓球的形狀，呈懸浮狀 態(tài)，折光性較好，在接種后的 12 h 左右，開始貼壁生 長，當(dāng)軟骨細胞在壁上生長 24 ～ 48 h，大部分軟骨 細胞貼壁伸展，形狀多呈現(xiàn)出三角形、扁平形及多角 形，部分細胞出現(xiàn)分裂相。甲苯胺藍染色后可見 細胞核呈深藍色，有 1～2 個核仁，胞質(zhì)呈淡藍色，細 胞外基質(zhì)著淺藍色。軟骨細胞的胞質(zhì)經(jīng)異 硫氰酸熒光素( FITC) 染色后發(fā)出鮮亮的綠色熒光， 呈強陽性，細胞核區(qū)域沒有著色。細胞核經(jīng) 4＇，6-二 脒基-2-苯基吲哚( DAPI) 染色后激發(fā)出藍色熒光。幾乎全部細胞表達了Ⅱ型膠原， 進一步證明本實驗得到了純度很高的軟骨細胞。

3 討 論

OA 是一種退行性變的疾病，好發(fā)于老年人，據(jù) 統(tǒng)計，我 國 40 歲以上人群原發(fā)性 OA 患 病 率 為 46. 3% 。OA 的特征性改變是軟骨的退變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)的增生，實驗室表現(xiàn)為進行性的關(guān)節(jié)軟骨 破壞和骨贅的形成，軟骨變性是 OA 的最基本病理 改變 。OA 可同時伴有不同程度的滑膜炎癥，最 終可以出現(xiàn)關(guān)節(jié)的疼痛、僵硬、肥大及功能活動等受到限制 。關(guān)節(jié)軟骨的退變與破壞是 OA 最主要 的病理環(huán)節(jié)，軟骨組織內(nèi)只有一種細胞成分，就是軟 骨細胞，而軟骨細胞在體內(nèi)不增殖 。為了本研 究的進一步進行，本研究采用體外實驗的實驗方法， 用 SD 雌性大鼠肋骨的軟骨細胞進行體外細胞培養(yǎng)。