銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，具有治 療困難、病情易反復等特點，其發(fā)病機制尚未明確，大 多認為銀屑病的發(fā)病是由多因素導致的，包括遺傳因 素、感染因素、免疫因素和環(huán)境因素等，目前研究發(fā)現 線粒體損傷、氧化應激與銀屑病的發(fā)病有著密切的關 系。過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 輔激活子 1α ( peroxisome proliferator － activated receptor － γ coactivator － 1α，PGC － 1α) 是調節(jié)線粒體生物合成的關鍵因 子，具有調節(jié)線粒體呼吸鏈復合物亞基表達從而減少 ＲOS 生成和調控體內抗氧化因子從而減少氧化應激 的作用。在抗機體氧化損傷中有重要意義。本研究旨 在通過研究銀屑病患者外周血單個核細胞( PBMC) PBMC 中 PGC － 1α 的表達從而探討線粒體障礙對銀 屑病的調節(jié)機制與涼血消風湯對銀屑病的治療機制。

收集2017 年5 月—2017 年12 月至天津市中醫(yī)藥 研究院附屬醫(yī)院皮膚科就診血熱型尋常型銀屑病患 者。血熱型診斷標準: 參照《中華人民共和國中醫(yī)藥 行業(yè)標準·中醫(yī)皮膚科病癥診斷療效標準》，主癥: 新 皮損不斷出現，以丘疹、斑丘疹為主，皮損基底皮膚顏 色鮮紅，刮去鱗屑有點狀出血，有同形反應。次癥: 初 發(fā)或復發(fā)，可有不同程度的瘙癢、心煩、口渴或口干、便 秘、尿黃、舌質紅、苔黃、脈數。具備以上主癥及次癥 2 項以上者即可診斷。

1. 2 納入標準及排除標準 納入標準

①符合尋常型銀屑病臨床診斷標準，10 ＜ PASI 評分 ＜ 30，處于銀屑病進行期;

②符合血熱證 診斷標準; ③年齡 10 ～ 70 歲; ④身心健康，無內科嚴重 心、肝、腎疾病，血尿便常規(guī)、肝腎功能及其它生化指標 正常并簽署知情同意書。

① 妊娠、哺乳期、 孕婦或 1 年內計劃妊娠者;

② 并有嚴重心、肝、腎疾 患、惡性腫瘤患者; 有嚴重感染、水電解質及酸堿平衡 紊亂者;

③其他證型銀屑病，如血瘀型銀屑病、血燥型 銀屑病。剔除標準: 納入后發(fā)現不符合納入標準，或未 按本治療方案規(guī)范實施的病例，需予別除，其結果不計 入最終統計分析。

① 不按時服用藥物、復 診或自行退出;

② 患者病情加重需使用其他藥物應急 處理者。

中藥組收集 18 例，脫落 4 例。其中男 6 例，女 8 例; 年齡最小 14 歲，最大 63 歲，平均( 37. 64 ± 13. 73) 歲。正常對照組收集 14 例健康人。其中，男 4 例，女 10 例; 年 齡 最 小 21 歲，最 大 65 歲，平 均 ( 40. 71 ± 12. 90) 歲。正常對照組選取年齡、性別與中藥組相匹配的健康人來源于本院體檢人群，經倫理委員會批準， 所有受試者均簽署之情同意書。

Annexin V － FITC /PI apoptosis kit ( 聯 科 生 物) ; PPAＲ GCIA antibody ( Sangon Biotech) ; Actin antibody ( Abcam) ; Goat Anti － Ｒabbit IgG，HＲP ( Sangon Biotech) ; ＲIPA 裂解液( 碧云天) ; Western blot 封閉液( BD 脫脂 奶 粉 配 制) ; PVDF 膜 ( Millipore ) ; BSA 緩 沖 液 ( Amresco) ; 30% 丙 烯 酰 胺 ( Amresco ) ; 流 式 細 胞 儀 ( BD) ; 雙垂直電泳槽( CAVOY) ; 溫控搖床( 其林貝爾) ; 電泳儀( CAVOY) 。

收集約 1 × 106 ～ 3 × 106 個細 胞，加 入 500μL Apoptosis Positive Control Solution 重 懸，置冰上孵育 30min 加入適量預冷 1 × Binding Buffer 重懸，并加入數量相同且未經處理的活細胞與之混合。 加入預冷 1 × Binding Buffer 補充至 1. 5 mL，等分成 3 管，其中一管為空白對照管、兩管為單染管。單染管分 別加入 5μL Annexin V － FITC 或 10μL PI，流式細胞儀 上，用空白管調節(jié) FSC、SSC 和熒光通道的電壓，并在 此電壓條件下，用單染管調節(jié)熒光通道的補償。

離心收集 1 ～ 5 × 105 個細胞，用雙 蒸水稀釋 5 × Binding Buffer 為 1 × Binding Buffer，取 500μL 1 × Binding Buffer 重懸細胞。每管加 入 5μL Annexin V － FITC 和 10μL PI 室溫避光孵育 5min。在 流式細胞儀上，通過 FITC 檢測通道檢測 Annexin V － FITC 和通過 PE 檢測通道檢測 PI。

①提取細胞總蛋白: 使用酶標儀進 行蛋白定量，根據 SDS － PAGE 上樣量需要，取適量樣 品加入 4 × loading buffer 后，100℃ 煮沸變性 5min;

② SDS － PAGE 電泳: 根據目的蛋白的分子量，配制 10% 分離膠凝膠，濃縮膠濃度為 4% 。待檢測蛋白樣品上樣量為 10 μL。濃縮膠恒壓 80V，約 40 min; 分離膠恒 壓 120V，電泳至溴酚藍到凝膠底部;

③轉膜: 采用濕轉 法，轉膜條件為 300 mA 恒流與 0. 45 μmPVDF 膜。冰 浴轉膜時間 2h。轉膜完成后用麗春紅染色試劑對膜 進行染色，觀察轉膜效果。設置恒流 300 mA，冰浴轉 膜 2 h。

中藥組治療前與正常組 PBMC 凋亡比例用成組 t 檢驗，結果 P = 0. 014( P ＜ 0. 05，差異有統計學意義) 。 治療前與治療后 PBMC 凋亡比例用配對 t 檢驗，結果 P = 0. 043( P ＜ 0. 05，差異有統計學意義) ，說明銀屑病 病人 PBMC 凋亡率高于正常人，經涼血消風湯治療后 病人凋亡率明顯下降，銀屑病治療前 PGC － 1α 蛋白表達較正常組下調， P = 0. 029( P ＜ 0. 05，差異有統計學意義) ，經中藥治療 后 PGC － 1α 蛋白表達較治療前上調，P = 0. 00 ( P ＜ 0. 01，差異有統計學意義) 。說明涼血消風湯治療有效。

線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，其主要 功能單位為位于線粒體內膜上的線粒體呼吸鏈。線粒體呼吸鏈由五個復合物構成，它們不但是 ATP 的主要 來源，也是 ＲOS 產生的主要場所。生理狀態(tài)下，呼 吸鏈在傳遞電子過程中會有 2% 的電子逃逸，與氧氣 反應產生超氧陰離子( O  2 ) ，O  2 部分還原生成過氧化 氫( H2O2 ) ，又進一步還原成羥自由基( ·OH) ，這些不 穩(wěn)定的自由基統稱為活性氧( ＲOS) 。一定濃度的 ＲOS 可參與細胞增殖、凋亡和 Ca 2 + 儲存等生理過程， 是細胞正常生命活動所必須的。線粒體呼吸鏈可以不 斷產生 ＲOS，而線粒體中存在許多的抗氧化酶，谷胱 甘肽過氧化物酶( GSH － Px) 等可以清除由活性氧和 ·OH 誘發(fā)的脂質過氧化物，使 ＲOS 維持在較低生理 水平。若線粒體功能障礙則會出現 ＲOS 生成的增 多和抗氧化因子生成減少，從而使體內的抗氧化防御 系統遭到破壞，大量 ＲOS 在體內蓄積，破壞脂質、蛋白 質、DNA 的結構和功能，從而導致氧化應激的發(fā)生。細胞凋亡主要有兩大經典途徑，即以線粒體為中 心的內源性凋亡途徑，以及由死亡受體介導的外源性 凋亡途徑。目前大多數學者認為，線粒體功能障礙起 源的凋亡途徑在凋亡發(fā)生過程中起核心作用。過多 的 ＲOS 可以引起構成線粒體內膜的脂質和蛋白質損 傷，促使線粒體內膜流動性和通透性改變，通透性轉換 孔( m PTP) 開啟。m PTP 開啟可改變線粒體膜電位和 滲透壓，使線粒體發(fā)生腫脹，線粒體呼吸鏈功能減弱， 甚至使線粒體膜破裂。細胞色素 C 從線粒體釋放標 志著細胞凋亡的開始，線粒體膜通透性增加后細胞 色素 C 被釋放到細胞質中激活 caspase 家族并誘導 caspase 級聯反應，最終使 caspase3 激活。而活化的 caspase3 可使多聚 ADP － 核糖聚合酶中與 DNA 結合 的 2 個鋅指結構與羧基端的催化區(qū)域分離，從而引起 細胞凋亡。





 

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