葛根素是野葛的主要成分，主要用于高血壓和冠 心病 等 的 治 療。葛根素難溶于水，生物 利 用 率 低。甘草的主要活性成分是甘草酸，甘草酸有 2 種 構(gòu)型，即 18α － 甘草酸和 18β － 甘草酸。本實(shí)驗(yàn) 研究這 2 種構(gòu)型的甘草酸對(duì)葛根素在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響。

材料與方法

1 材料

動(dòng)物 雄性 SD 大鼠，體重 180 ～ 200 g，由北京維 通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物許可證號(hào): SYXK( 冀) 2005 － 0038。 藥品與試劑 葛根素對(duì)照品，規(guī)格: 每支 20 mg， 批號(hào): 110752 － 200809，由中國(guó)食品藥品檢定研究院 提供; 肝素鈉注射液，規(guī)格: 每支 2 mL /1. 25 × 104 U， 批號(hào): 20100416，江蘇萬(wàn)邦生化有限公司生產(chǎn); 18 － α 甘 草 酸 和 18 － β 甘 草 酸，純 度: ≥ 90% ，批 號(hào): 20100321，南京澤朗藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。甲醇，美國(guó) Fisher Chemicals 公司生產(chǎn); 羧甲基纖維素鈉，國(guó)藥集 團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。 儀器 高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品; 旋渦混合器VORTEX-5，海門(mén)市其林貝爾產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2. 1 葛根素血藥濃度方法的建立

2. 1. 1 色譜條件

色譜柱: Diamonsil C18 ( 250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ， 流動(dòng)相: 甲醇 － 水( 30∶ 70) ，檢測(cè)波長(zhǎng): 250 nm，流速: 1. 00 mL·min － 1，柱溫: 30 ℃，進(jìn)樣量: 10 μL。

2. 1. 2 對(duì)照品溶液的制備

將葛根素對(duì)照品 4 mg 置于 50 mL 的容量瓶中， 加甲 醇 溶 解 并 稀 釋 至 刻 度，搖 勻，制 成 濃 度 為 80 μg·mL － 1對(duì)照品儲(chǔ)備液備用。

2. 1. 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取上述儲(chǔ)備液，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為 2，4，8，16，20，40，80 μg·mL － 1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述系 列標(biāo)準(zhǔn)溶液 10 μL，分別加入大鼠空白血漿 200 μL， 得到質(zhì)量濃度分別為 0. 1，0. 2，0. 4，0. 8，1. 0，2. 0， 4. 0 μg·mL － 1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品系列。按照“血漿預(yù)處 理方法”進(jìn)行處理，然后將處理好的上述血漿樣品依 次進(jìn)樣 10 μL，測(cè)定峰面積。以峰面積( Y) 對(duì)血漿濃 度( X) 進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 1. 4 專(zhuān)屬性取空白血漿加入葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液

制成葛根 素的血漿樣品，按“血漿預(yù)處理方法”進(jìn)行處理后，在 上述色譜條件下分別進(jìn)樣觀察。

2. 1. 5 精密度與回收率

取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液分別配制成 3 種質(zhì)量濃度 ( 0. 1，0. 8，4. 0 μg·mL － 1 ) 的葛根素樣品溶液，按照 “血漿預(yù)處理方法”進(jìn)行處理后，分別進(jìn)樣 10 μL，測(cè) 定峰面積，分別于日內(nèi)進(jìn)樣 5 次，考察日內(nèi)精密度; 每 天同一時(shí)間進(jìn)樣 1 次，共進(jìn)樣 5 d，考察日間精密度。 另取血漿樣品，分別配制成 3 種質(zhì)量濃度( 0. 1，0. 8， 4. 0 μg·mL － 1 ) 的葛根素樣品溶液，按照“血漿預(yù)處理 方法”進(jìn)行處理后，分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以?xún)烧叻迕?積相比，計(jì)算出葛根素在血漿提取中的絕對(duì)回收率。

2. 1. 6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取大 鼠 空 白 血 漿 2. 0 mL，加入質(zhì)量濃度為 0. 1 mg·mL － 1葛根素甲醇溶液 20 μL，血漿中葛根素 的質(zhì)量濃度為 1. 0 μg·mL － 1，平行取 8 份，于 － 20 ℃ 冷凍保存。分別于 0，12，24，48，72，120，144，168 h， 按“血漿樣預(yù)處理方法”處理樣品，進(jìn)行 HPLC 測(cè)定。

2. 2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2. 2. 1 分組、給藥與取樣

按照體重將雄性 SD 大鼠隨機(jī)分為 3 組: 聯(lián)合 α 組、聯(lián)合 β 組和葛根素組，每組 7 只。 聯(lián)合 α 組灌胃甘草酸二銨，聯(lián)合 β 組給予甘草酸 單銨，給藥量為 150 mg·kg － 1，給藥誘導(dǎo) 7 d; 葛根素組 自由進(jìn)食，第 7 天 3 組均灌胃葛根素 100 mg·kg － 1。00 min，于大鼠眼球后靜脈叢取血。

2. 2. 2 血漿樣品預(yù)處理方法的確定

將大鼠全血置于涂有肝素抗凝劑的離心管中，以 1. 2 × 104 r·min － 1離心 5 min。取上清 200 μL，置于 1. 5 mL 的離心管中，加入甲醇 800 μL，密塞。經(jīng) 0. 45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾后，取上清液。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用 3P97 藥代動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以 x珋± s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用 LSD 檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1. 1 專(zhuān)屬性

葛根素與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為 13. 34 和 5. 91 min，表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾葛根素和內(nèi)標(biāo)的 測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖 1。

1. 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

Y = 38. 26X + 0. 97，r = 0. 999 5。葛根素血漿質(zhì)量 濃度在 0. 1 ～ 4. 0 μg·mL － 1內(nèi)線性關(guān)系良好。

1. 3 精密度與回收率

結(jié)果見(jiàn)表 1，表明該方法可滿(mǎn)足生物樣品分析 要求。1. 4 穩(wěn)定性 在 － 20 ℃、7 d 內(nèi)，葛根素在大鼠血漿中，含量幾 乎無(wú)變化，說(shuō)明葛根素在大鼠血漿中的穩(wěn)定性好。

2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

葛根素、聯(lián)合 α 組和聯(lián)合 β 組的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng) 力學(xué)過(guò)程均符合兩房室模型。聯(lián)合 α 組與葛根素組 比較，AUC、t1 /2α、t1 /2β和 Cmax均明顯增加，差異均有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義( 均 P ＜ 0. 05) ; 聯(lián)合 β 組與葛根素組比較， AUC、t1 /2α、t1 /2β和 Cmax均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義( 均 P ＜ 0. 05) 。結(jié)果見(jiàn)表 2。



討 論

本實(shí)驗(yàn)中，血漿樣品經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，最后選用甲醇 來(lái)沉淀血漿中的蛋白，葛根素提取率較高，處理后的 血漿樣品可直接進(jìn)樣測(cè)定; 同時(shí)，血漿中內(nèi)源性物質(zhì) 及代謝物產(chǎn)物對(duì)葛根素的測(cè)定不干擾，具有專(zhuān)屬性 高、準(zhǔn)確度好、回收率高和簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，可用于葛 根素藥代動(dòng)力學(xué)的研究。