近年來,食源性致病菌生物菌膜已成為食品安全領(lǐng) 域中的研究熱點。生物菌膜是細菌在生長過程中為適 應生存環(huán)境而黏附、生長于組織表面,在菌體-菌體和菌 體-接觸面的相互作用下,通過菌體增殖、分泌胞外基質(zhì) 而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的細菌聚集體。形成菌膜 后,細菌菌體對外界環(huán)境的抵抗力會大大增強,對工業(yè) 清洗劑和消毒劑具有更強耐受性,不易清除,殘留的生 物菌膜可在環(huán)境適宜時脫落出細菌菌體,成為潛在污染 源,進一步造成交叉污染,引發(fā)嚴重的食品安全問題。 大腸桿菌O157:H7是全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的食源性致病 菌,每年都會爆發(fā)多起因大腸桿菌O157:H7污染而引發(fā)的 食物中毒事件。有研究表明,大腸桿菌O157:H7在固體表 面(如加工器械表面、畜禽胴體表面等)產(chǎn)生黏附的特 性是其造成交叉污染的主要原因。
1 材料與方法
1.1 菌株、材料與試劑
實驗用大腸桿菌O157:H7共1 4 株,包括菌株 CICC21530(購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心) 菌株ATCC43895(購自美國菌種保藏中心)、菌株 NCTC12900(購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司), 其余11 株為南京師范大學食品與制藥工程學院實驗室 分離自牛肉和牛糞。胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soya agar,TSA)培 養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)、 胰蛋白胨大豆瓊脂酵母提取物(tryptone soya agar yeast extract,TSAYE)培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司; LIVE/DEAD® BacLight Bacterial Viability Kits(L7012) 美國Molecular Probes公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、 氯化鈉、結(jié)晶紫、乳酸、戊二醛、鋨酸、乙醇 南京化 學試劑有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
M2多功能酶標儀 美國Molecular Devices公 司;SZX超凈工作臺 上海浦東躍欣儀器廠;LDZX30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠; SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國Baker公司; 拍打式均質(zhì)器 青島眾瑞智能儀器有限公司;生化培 養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;QL-200微型 漩渦混合儀 海門其林貝爾儀器有限公司;2-16KL高 速冷凍離心機 美國Sigma公司;DHP-9052型電熱恒 溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;LSM 710 CLSM 德國Carl Zeiss公司。
1.3 方法
1.3.1 菌液制備
凍藏的14 株大腸桿菌O157:H7經(jīng)TSA平板劃線,于 37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種至3 mL TSB中,37 ℃ 搖床培養(yǎng)18 h,再吸取1 mL菌液轉(zhuǎn)接至100 mL TSB 中,37 ℃搖床培養(yǎng)18 h,使菌液濃度達到108 CFU/mL 左右。取1 mL培養(yǎng)好的菌液離心(6 000×g、5 min、 4 ℃),棄去上清液,用磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)洗滌 2 次,重懸后備用。
1.3.2 大腸桿菌O157:H7黏附性能比較
采用微孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法。取500?μL 備用菌液,接種至一定體積TSB中(菌體濃度約為 2~3(lg(CFU/mL))。吸取180?μL置于96 孔細胞培養(yǎng) 板中,封口膜包被,于25 ℃培養(yǎng)72 h,以不接種細菌的 TSB作為空白對照。培養(yǎng)結(jié)束后,棄去微孔中的細菌培 養(yǎng)液,無菌蒸餾水洗滌3 次,室溫下干燥45 min后,每孔 加入200?μL?0.25?g/100 mL結(jié)晶紫染液染色30 min,棄去 染液并用無菌蒸餾水洗滌3 次,200 µL體積分數(shù)95%乙醇 溶液洗脫30 min,最后將微孔板置于酶標儀中在570 nm 波長處測定其OD值。每個菌株重復6 次。
1.3.3 微孔法分析大腸桿菌O157:H7生物菌膜的形成曲線
根據(jù)1.3.2節(jié)結(jié)果,選取生物菌膜形成能力不同的幾 株大腸桿菌O157:H7,按1.3.2節(jié)方法進行微孔板操作,分別在培養(yǎng)2、4、8、12、16、24、36、48、60、72、 120、168 h取樣,以不接種的TSB作為對照組。經(jīng)結(jié)晶 紫染液染色、乙醇洗脫,570 nm波長處測定其OD值,所 得OD值按照培養(yǎng)時間繪制菌膜形成曲線。每個菌株每個 時間點均重復6 次。
1.3.4 酸應激對菌株生物菌膜形成的影響
根據(jù)1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)結(jié)果選取代表菌株,研究酸 應激對其生物菌膜形成的影響。用3 mol/L乳酸溶液和 1 mol/L鹽酸溶液分別配制系列pH值梯度(pH 3.5、 4.0、4.5、5.0)TSB作為酸性培養(yǎng)液,同時以未經(jīng)酸處 理的正常TSB作為對照。采用機械脫落平板計數(shù)法檢 測菌膜形成。 按1.3.1節(jié)方法進行菌液制備,取100?μL備用菌液接 種于10 mL載有不銹鋼片的上述不同酸度TSB中,菌液 濃度約為106 CFU/mL。將接種好的樣品于25 ℃靜置培養(yǎng) 2、4、8、12、24、48、72、120、168 h,規(guī)定時間取樣 后,對培養(yǎng)裝置里的浮游菌數(shù)和不銹鋼表面形成的生物 菌膜進行計數(shù)。生物菌膜計數(shù)前用無菌生理鹽水清洗不 銹鋼片3 次以去除鋼片表面未黏附的游離菌體,用拍擊沖擊法采集鋼片表面的黏附菌體,將清洗后的載有生物 菌膜的不銹鋼片放入裝有80 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋 中,并放入少量無菌棉,在480 擊/min條件下拍擊60 s, 吸取均質(zhì)液進行梯度稀釋,涂布至TSAYE平板中,37 ℃ 下培養(yǎng)24 h后計數(shù)。每組實驗重復3 次。
1.3.5 酸應激下不同黏附力菌株生物菌膜的CLSM觀察
根據(jù)1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)結(jié)果選取黏附力不同的代表 菌株,采用CLSM比較不同pH值時代表菌株生物菌膜 的結(jié)構(gòu)變化。按1.3.1節(jié)方法制備菌液,取100?μL備用 菌液接種于10 mL載有不銹鋼片的酸性和正常TSB中, 菌液濃度約為106 CFU/mL。將接種好的樣品于25 ℃靜 置培養(yǎng),分別在24、72 h和168 h取出,無菌蒸餾水充 分洗滌不銹鋼片以去除其上的游離菌體,吸取LIVE/ DEAD® 熒光染液對不銹鋼片表面進行染色,室溫避光 條件下充分作用15 min后,用無菌蒸餾水充分洗滌不銹 鋼片以除去多余熒光染料,室溫避光條件下放置自然干 燥,使用CLSM(60×,油鏡)觀察染色后的生物菌膜 結(jié)構(gòu)。LIVE/DEAD® 為由核酸染料SYTO 9和碘化丙啶 (propidium iodide,PI)復配的熒光染料;其中SYTO 9 激發(fā)波長和吸收波長分別為480 nm和500 nm,可以將生 物菌膜中具有完整細胞膜的菌體(活菌)染成綠色,PI 激發(fā)波長和吸收波長分別為490 nm和635 nm,可以將生 物菌膜中細胞膜損傷的菌體(死菌)染成紅色,從而可 以區(qū)別生物菌膜中的活菌和死菌。每組隨機選用10 張 CLSM圖像,使用NIS-Element Viewer軟件和Image J 軟件 對圖像進行處理。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
數(shù)據(jù)處理應用SPSS 17.0軟件,采用單因素方差分析 及Duncan’s多重比較檢驗進行差異顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
進一步選取中等黏附力菌 株ATCC43895為代表菌株,利用機械脫落平板計數(shù)法觀 察酸應激下不銹鋼表面該菌株生物菌膜的形成。結(jié)果表 明,pH 3.5乳酸-TSB的抑菌效應強,該菌株浮游菌數(shù)和 生物菌膜形成數(shù)量均未達到檢測限,而pH 3.5鹽酸-TSB 對該菌株浮游菌數(shù)和生物菌膜數(shù)量影響均較小,故對 pH 3.5乳酸-TSB和pH 4.0、4.5、5.0鹽酸-TSB未作進一步 研究。示。培養(yǎng)24 h時可 發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)條件下均開始有少量單個菌體黏附于不銹 鋼表面,培養(yǎng)72 h時正常TSB中已有少量小的細菌“團 狀物”出現(xiàn),而pH 5.0乳酸-TSB組中的菌體出現(xiàn)連接趨 勢,但未觀測到“團狀物”出現(xiàn),培養(yǎng)168 h時正常TSB 中的菌體連接成“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu),而pH 5.0乳酸-TSB組中 的菌體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比較松散,且觀察到較多紅色菌體,表 明死菌數(shù)明顯增加。
3 討 論
食源性致病菌生物菌膜比游離菌體對食品安全的威 脅更大,菌體形成成熟生物菌膜的初始步驟是黏附于接觸面,因此本研究首先對14 株大腸桿菌O157:H7黏附 性能進行比較,發(fā)現(xiàn)14 株菌株均能在聚苯乙烯微孔表面產(chǎn)生黏附,表明這些大腸桿菌O157:H7都具有形成生物菌 膜的能力,但不同菌株菌膜形成能力存在差異。
4 結(jié) 論
生物菌膜是食品加工中微生物交叉污染的源頭,本 實驗結(jié)合食品加工實際環(huán)境探究較長時間酸應激對大腸 桿菌O157:H7生物菌膜形成的影響。采用微孔板結(jié)合結(jié)晶 紫染色法比較14 株大腸桿菌O157:H7黏附性能差異,結(jié) 果發(fā)現(xiàn)黏附性能存在明顯菌株差異。選取較強黏附力菌 株J29,中等黏附力菌株ATCC43895和4 株較弱黏附力菌 株,采用微孔板結(jié)合結(jié)晶紫染色法觀察菌膜形成曲線, 結(jié)果表明各菌株均在培養(yǎng)2 h開始產(chǎn)生黏附,但黏附性能 不同的菌株其菌膜形成曲線呈現(xiàn)明顯差異。
免責聲明:文章僅供學習和交流,如涉及作品版權(quán)問題需要我方刪除,請聯(lián)系我們,我們會在第一時間進行處理。