青風(fēng)藤堿(Sinoacutine,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1A)為異喹啉類 生物堿,是從防己科千金藤屬云南地不容(Stephania yunnanensis Lo)等多種植物中提取分離而得。研究發(fā) 現(xiàn),青風(fēng)藤堿具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗心律失常等活 性,例如青風(fēng)藤堿能明顯提高小鼠熱板痛閾和足趾電刺 激痛閾,減少醋酸所致的小鼠扭體次數(shù);與戊巴比妥鈉 聯(lián)用后,可增強(qiáng)后者的鎮(zhèn)靜催眠作用;此外,青風(fēng)藤堿 還具有抗Ⅱ型膠原蛋白致大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用, 并可明顯降低氯仿致小鼠室顫的發(fā)生率 。本課題組 前期研究發(fā)現(xiàn),青風(fēng)藤堿能明顯縮短氯化鋇致心律失常 模型大鼠恢復(fù)竇性心律所需的時(shí)間。
1 材料
1.1 儀器
1260 型 HPLC 儀(美國(guó) Agilent 公司);HSC-12A 型氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);TGL-16G型高 速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XK96-A型快速 混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);BT25S型分析 天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];SK3300型超 聲機(jī)(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);其林貝爾BE-1100型四維旋 轉(zhuǎn)混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。
1.2 藥品與試劑
青風(fēng)藤堿原料藥(純度:98%)、青風(fēng)藤堿對(duì)照品(純 度:98%)均為本實(shí)驗(yàn)室自制;青藤堿對(duì)照品(內(nèi)標(biāo),中國(guó) 食品藥品檢定研究院,批號(hào):110774- 201808,純度:供鑒 別和含量測(cè)定用);甲醇為色譜純,乙酸乙酯、乙胺等其 余試劑均為分析純,水為純化水。
1.3 動(dòng)物
SPF級(jí)健康家兔12只,雌雄各半,10~12周齡,體質(zhì) 量 2.0~2.5 kg,購(gòu)自昆明楚商科技有限公司,動(dòng)物生產(chǎn) 許可證號(hào):SCXK(滇)K2018-0001。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色 譜 柱 :Agilent Zorbax Extend-C18(250 mm × 4.6mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-2 mmol/L磷酸氫二鈉水溶液 (含 0.016%三乙胺,pH 為 9.8)(45 ∶ 55,V/V);流速: 1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):262 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。
2.2 溶液的配制
2.2.1 青風(fēng)藤堿標(biāo)準(zhǔn)溶液
精密稱取青風(fēng)藤堿對(duì)照品 10 mg于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成質(zhì)量濃 度為1.0 mg/mL的對(duì)照品貯備液。取上述對(duì)照品貯備液 適量,用甲醇進(jìn)一步稀釋,制成質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、 10.0、15.0、25.0、40.0、50.0 mg/L的青風(fēng)藤堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶 液,于-20 ℃下密封保存,備用。
2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液
精密稱取青藤堿對(duì)照品 10 mg 于 10 mL 量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成質(zhì)量濃度為 1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。取上述內(nèi)標(biāo)貯備液適量,用甲醇 進(jìn)一步稀釋,制成質(zhì)量濃度為 100.0 mg/L 的內(nèi)標(biāo)溶液, 于-20 ℃下密封保存,備用。
2.2.3 青風(fēng)藤堿藥液
精密稱取青風(fēng)藤堿原料藥 250 mg 于 50 mL 量瓶中,加入 10%檸檬酸溶液 1 mL,超聲 (功率:400 W,頻率:40 kHz)溶解,加生理鹽水定容,制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的青風(fēng)藤堿藥液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。
2.3 血漿樣品的處理
精密吸取血漿樣品0.5 mL,加入100.0 mg/L內(nèi)標(biāo)溶 液20 μL,渦旋3 min,加入乙酸乙酯3 mL,渦旋3 min,使 用四維旋轉(zhuǎn)混合儀萃取 20 min 后,以 6 000 r/min 離心 10 min;精密吸取上清液2.4 mL,于50 ℃水浴中以氮?dú)?流吹干;殘?jiān)尤爰状?150 μL 復(fù)溶,渦旋 3 min 后,以 4 000 r/min離心10 min,取上清液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜 濾過(guò),取續(xù)濾液20 μL,進(jìn)樣分析。
2.4 方法學(xué)考察
2.4.1 專屬性
取空白血漿、空白血漿+內(nèi)標(biāo)(100.0 mg/L)+青風(fēng)藤堿(50.0 mg/L)、雌性家兔給藥后5 min的 血漿樣品各適量,按“2.3”項(xiàng)下方法處理(其中,空白血漿 不加內(nèi)標(biāo)溶液)后,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記 錄色譜圖。結(jié)果,各待測(cè)物的理論板數(shù)均大于4 000;內(nèi) 標(biāo)與青風(fēng)藤堿的保留時(shí)間分別約為20.8、24.3 min,呈基 線分離,分離度大于 1.5,且血漿內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾,。
2.4.2 線性關(guān)系、定量下限及最低檢測(cè)限考察
精密量 取家兔空白血漿450 μL,分別加入“2.2.1”項(xiàng)下青風(fēng)藤堿 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μL,得質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、 1.5、2.5、4.0、5.0 mg/L的青風(fēng)藤堿系列血漿樣品,按“2.3” 項(xiàng)下方法處理后,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記 錄色譜圖。以待測(cè)物質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo)、待測(cè) 物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得 回歸方程為 y=0.504 5x-0.072 9(r=0.999 5)。結(jié)果, 青風(fēng)藤堿檢測(cè)血藥濃度的線性范圍為0.1~5.0 mg/L,定量下限為0.1 mg/L(信噪比為10 ∶ 1);以信噪比3 ∶ 1測(cè)得 最低檢測(cè)限為0.08 mg/L。
3 討論
3.1 內(nèi)標(biāo)化合物的選擇
采用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)了家兔血漿中青風(fēng)藤堿的 質(zhì)量濃度。在前期內(nèi)標(biāo)化合物的篩選中,筆者以色譜峰 峰形及提取回收率為指標(biāo),對(duì)克班寧、異克利定、荷葉 堿、光千金藤定堿、青藤堿等5種異喹啉類生物堿進(jìn)行了 考察。結(jié)果顯示,上述化合物的提取回收率為 67%~85%,RSD均小于15%,其中以青藤堿的提取回收率最 為穩(wěn)定且相對(duì)較高;此外,青藤堿與青風(fēng)藤堿的保留時(shí) 間雖較為接近,但峰形和分離度均較好,有利于縮短檢 測(cè)所需時(shí)間,故最終選擇青藤堿作為內(nèi)標(biāo)。
3.2 色譜條件的優(yōu)化及血漿樣品處理方法的篩選
本研究在2015年版《中國(guó)藥典》(一部)青風(fēng)藤中青 藤堿含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu) 化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),青風(fēng)藤堿和青藤堿對(duì)流動(dòng)相的比例和 pH 值非常敏感,最終本研究將色譜條件確定為甲醇-2 mmol/L 磷酸氫二鈉水溶液(含 0.016%三乙胺,pH 為 9.8)(45 ∶ 55,V/V)。在血漿樣品處理方法的篩選過(guò)程中, 筆者分別嘗試了蛋白直接沉淀法和液-液萃取法,先后 以甲醇、乙腈以及異丙醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯單獨(dú)或不同比例混合作為沉淀或萃取試劑。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)發(fā) 現(xiàn),經(jīng)乙酸乙酯萃取后,待測(cè)物的峰形較為理想且分離 度良好,回收率相對(duì)較高且穩(wěn)定,故最終選擇乙酸乙酯 作為萃取溶劑。方法學(xué)考察結(jié)果顯示,本研究所建 HPLC法具有簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),且提取 方法不影響待測(cè)物的定量分析,符合生物樣品定量分析 的相關(guān)要求,可用于血漿樣品中青風(fēng)藤堿含量的測(cè) 定。此外,本研究所建標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍雖然較窄 (0.1~5.0 mg/L),但由于后續(xù)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)給藥劑量單 一、家兔體內(nèi)血藥濃度變化亦不大,故實(shí)用性尚可。
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