青風(fēng)藤堿（Sinoacutine，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1A）為異喹啉類 生物堿，是從防己科千金藤屬云南地不容（Stephania yunnanensis Lo）等多種植物中提取分離而得。研究發(fā) 現(xiàn)，青風(fēng)藤堿具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗心律失常等活 性，例如青風(fēng)藤堿能明顯提高小鼠熱板痛閾和足趾電刺 激痛閾，減少醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)；與戊巴比妥鈉 聯(lián)用后，可增強(qiáng)后者的鎮(zhèn)靜催眠作用；此外，青風(fēng)藤堿 還具有抗Ⅱ型膠原蛋白致大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用， 并可明顯降低氯仿致小鼠室顫的發(fā)生率 。本課題組 前期研究發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤堿能明顯縮短氯化鋇致心律失常 模型大鼠恢復(fù)竇性心律所需的時(shí)間。

1 材料

1.1 儀器

1260 型 HPLC 儀（美國(guó) Agilent 公司）；HSC-12A 型氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；TGL-16G型高 速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XK96-A型快速 混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；BT25S型分析 天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；SK3300型超 聲機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；其林貝爾BE-1100型四維旋 轉(zhuǎn)混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

青風(fēng)藤堿原料藥（純度：98％）、青風(fēng)藤堿對(duì)照品（純 度：98％）均為本實(shí)驗(yàn)室自制；青藤堿對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，中國(guó) 食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110774- 201808，純度：供鑒 別和含量測(cè)定用）；甲醇為色譜純，乙酸乙酯、乙胺等其 余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康家兔12只，雌雄各半，10～12周齡，體質(zhì) 量 2.0～2.5 kg，購(gòu)自昆明楚商科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn) 許可證號(hào)：SCXK（滇）K2018-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱 ：Agilent Zorbax Extend-C18（250 mm × 4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-2 mmol/L磷酸氫二鈉水溶液 （含 0.016％三乙胺，pH 為 9.8）（45 ∶ 55，V/V）；流速： 1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：262 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 青風(fēng)藤堿標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密稱取青風(fēng)藤堿對(duì)照品 10 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃 度為1.0 mg/mL的對(duì)照品貯備液。取上述對(duì)照品貯備液 適量，用甲醇進(jìn)一步稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、 10.0、15.0、25.0、40.0、50.0 mg/L的青風(fēng)藤堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶 液，于－20 ℃下密封保存，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取青藤堿對(duì)照品 10 mg 于 10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為 1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。取上述內(nèi)標(biāo)貯備液適量，用甲醇 進(jìn)一步稀釋，制成質(zhì)量濃度為 100.0 mg/L 的內(nèi)標(biāo)溶液， 于－20 ℃下密封保存，備用。

2.2.3 青風(fēng)藤堿藥液

精密稱取青風(fēng)藤堿原料藥 250 mg 于 50 mL 量瓶中，加入 10％檸檬酸溶液 1 mL，超聲 （功率：400 W，頻率：40 kHz）溶解，加生理鹽水定容，制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的青風(fēng)藤堿藥液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2.3 血漿樣品的處理

精密吸取血漿樣品0.5 mL，加入100.0 mg/L內(nèi)標(biāo)溶 液20 μL，渦旋3 min，加入乙酸乙酯3 mL，渦旋3 min，使 用四維旋轉(zhuǎn)混合儀萃取 20 min 后，以 6 000 r/min 離心 10 min；精密吸取上清液2.4 mL，于50 ℃水浴中以氮?dú)?流吹干；殘?jiān)尤爰状?150 μL 復(fù)溶，渦旋 3 min 后，以 4 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜 濾過(guò)，取續(xù)濾液20 μL，進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性

取空白血漿、空白血漿+內(nèi)標(biāo)（100.0 mg/L）+青風(fēng)藤堿（50.0 mg/L）、雌性家兔給藥后5 min的 血漿樣品各適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理（其中，空白血漿 不加內(nèi)標(biāo)溶液）后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記 錄色譜圖。結(jié)果，各待測(cè)物的理論板數(shù)均大于4 000；內(nèi) 標(biāo)與青風(fēng)藤堿的保留時(shí)間分別約為20.8、24.3 min，呈基 線分離，分離度大于 1.5，且血漿內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾，。

2.4.2 線性關(guān)系、定量下限及最低檢測(cè)限考察

精密量 取家兔空白血漿450 μL，分別加入“2.2.1”項(xiàng)下青風(fēng)藤堿 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μL，得質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、 1.5、2.5、4.0、5.0 mg/L的青風(fēng)藤堿系列血漿樣品，按“2.3” 項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記 錄色譜圖。以待測(cè)物質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)、待測(cè) 物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得 回歸方程為 y＝0.504 5x－0.072 9（r＝0.999 5）。結(jié)果， 青風(fēng)藤堿檢測(cè)血藥濃度的線性范圍為0.1～5.0 mg/L，定量下限為0.1 mg/L（信噪比為10 ∶ 1）；以信噪比3 ∶ 1測(cè)得 最低檢測(cè)限為0.08 mg/L。


3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)化合物的選擇

采用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)了家兔血漿中青風(fēng)藤堿的 質(zhì)量濃度。在前期內(nèi)標(biāo)化合物的篩選中，筆者以色譜峰 峰形及提取回收率為指標(biāo)，對(duì)克班寧、異克利定、荷葉 堿、光千金藤定堿、青藤堿等5種異喹啉類生物堿進(jìn)行了 考察。結(jié)果顯示，上述化合物的提取回收率為 67％～85％，RSD均小于15％，其中以青藤堿的提取回收率最 為穩(wěn)定且相對(duì)較高；此外，青藤堿與青風(fēng)藤堿的保留時(shí) 間雖較為接近，但峰形和分離度均較好，有利于縮短檢 測(cè)所需時(shí)間，故最終選擇青藤堿作為內(nèi)標(biāo)。

3.2 色譜條件的優(yōu)化及血漿樣品處理方法的篩選

本研究在2015年版《中國(guó)藥典》（一部）青風(fēng)藤中青 藤堿含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu) 化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤堿和青藤堿對(duì)流動(dòng)相的比例和 pH 值非常敏感，最終本研究將色譜條件確定為甲醇-2 mmol/L 磷酸氫二鈉水溶液（含 0.016％三乙胺，pH 為 9.8）（45 ∶ 55，V/V）。在血漿樣品處理方法的篩選過(guò)程中， 筆者分別嘗試了蛋白直接沉淀法和液-液萃取法，先后 以甲醇、乙腈以及異丙醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯單獨(dú)或不同比例混合作為沉淀或萃取試劑。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)，經(jīng)乙酸乙酯萃取后，待測(cè)物的峰形較為理想且分離 度良好，回收率相對(duì)較高且穩(wěn)定，故最終選擇乙酸乙酯 作為萃取溶劑。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本研究所建 HPLC法具有簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，且提取 方法不影響待測(cè)物的定量分析，符合生物樣品定量分析 的相關(guān)要求，可用于血漿樣品中青風(fēng)藤堿含量的測(cè) 定。此外，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍雖然較窄 （0.1～5.0 mg/L），但由于后續(xù)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)給藥劑量單 一、家兔體內(nèi)血藥濃度變化亦不大，故實(shí)用性尚可。



 

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