0 引言

  香蕉作為熱帶和亞熱帶水果在人 們的日常生活中扮演著重要角色。近年來，隨著香 蕉枯萎病的不斷加劇和蔓延，已給我國乃至全球香 蕉產(chǎn)業(yè)帶來了重創(chuàng)。香蕉 枯萎病是一種極具破壞性的土傳病害，其發(fā)病過程 為尖孢鐮刀菌侵染香蕉維管束，維管束腐爛壞死，香蕉枯萎死亡。香蕉枯萎病于1967 年首次出現(xiàn)在我國臺灣省，隨后從廣東蔓延至福建， 并迅速擴展到海南、廣西、云南等其他香蕉種植區(qū) ，嚴(yán)重威脅我國香蕉 種植業(yè)的發(fā)展。目前應(yīng)對香蕉枯萎病的主要措施有 化學(xué)防治、物理防治、培育抗病品種、生物防治及田 間綜合管理等，其中，生物防治措施憑借其對環(huán)境污 染小、安全程度高、能提高香蕉產(chǎn)量和品質(zhì)等優(yōu)點而 越來越受到研究者們的重視。

1 材料與方法

1. 1 試驗地概況

試驗地位于廣東省湛江市徐聞縣邁陳鎮(zhèn)那種 基地（東經(jīng)110°10′ 17.90″，北緯20°19′ 39.90″），氣候 類型為熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫23.5 ℃，年平均降 水量1364 mm。試驗區(qū)為連續(xù)8年種植韭菜的平整 地塊，土壤類型為磚紅壤，土壤理化性質(zhì)為有機質(zhì) 14.4 g/kg、堿解氮62.3 mg/kg、有效磷（P2O5）38.0 mg/ kg、速效鉀（K2O）108.6 mg/kg、pH 5.6。

1. 2 試驗材料

供試香蕉品種：巴西蕉（Cavendish，cv. Brazilium AAA，香蕉枯萎病感病品種）組培苗。供試病原菌： 帶有標(biāo)記綠色熒光蛋白的香蕉枯萎病菌4號生理小 種（簡寫GFP-FOC4），由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究 所李春雨博士饋贈，致病性與野生型菌株一致。供 試生防菌：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）XP1，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研 究所提供。XP1培養(yǎng)條件：利用PDA和LB混合培養(yǎng) 基在28 ℃的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d，抑菌圈直徑為 62.5 mm（孫杰，2018）；PDA和LB混合培養(yǎng)基配方： 馬鈴薯200 g、葡萄糖（C6H12O6 ·H2O）20 g、胰蛋白胨 10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1000 mL。 主要試劑：MOBIO PowerSoil® DNA Isolation Kit試劑盒（貨號12888-100）購自北京寶杰羅生物科 技有限公司（MOBIO）；Premix Taq（E×Taq Version 2.0 Plus）（貨號RR902A）、DL15000 DNA Marker（貨 號 3582A）、100 bp DNA Ladder（貨 號 3422A）和 DL2000 DNA Marker（貨號3247A）購自寶日醫(yī)生物 技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）；Primer（訂購合成） 和 Quant-iTTM Broad-Range DNA Assay（ 貨 號 Q32853）購自美國英杰生命技術(shù)有限公司（Invitrogen）；瓊脂糖（貨號111860）購自廣州浩瑪生物科技有 限公司。主要儀器：PCR擴增儀（型號 ABI9600，美 國）和Daek reader（型號DR-46B）購自Clare Chemical Research；QubitTM Fluorometer（型 號 Qubit® 2.0 Fluorometer）購自Invitrogen公司；微型離心機（型號 Baygene BG-Qspin#8482）購自Baygene；渦旋混合器 （型號其林貝爾QL-901）購自其林貝爾儀器制造有限公司；凝 膠成像儀（型號Tanon 4100）購自上海天能科技有限 公司。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 試驗設(shè)計

試驗設(shè)3個處理，每處理3次重 復(fù)，隨機區(qū)組排列，共9個小區(qū)，小區(qū)面積223 m2 。其 中，CK：健康蕉園+每株0.5 L滅菌PDA培養(yǎng)基灌根+ 每株0.5 L滅菌LB培養(yǎng)基灌根；DI：健康蕉園+香蕉枯 萎病菌（菌液濃度1×109 個/mL，接種量0.5 L/株）+每 株0.5 L滅菌LB培養(yǎng)基；TR：健康蕉園+香蕉枯萎病 菌（菌液濃度1×109 個/mL，接種量0.5 L/株）+生防菌 （菌液濃度1×109 個/mL，接種量0.5 L/株）。 香蕉枯萎病菌采用灌根法在香蕉7~8片葉、株 高40~50 cm時接種。TR處理生防菌劑是在香蕉枯 萎病菌接種后24 h灌根。香蕉種植密度為60株/223 m2 ，起壟種植，株行距1.5 m×2.5 m。

1. 3. 2 根際土壤采集方法

土壤樣品于DI處理小 區(qū)95%香蕉植株出現(xiàn)發(fā)病癥狀時進(jìn)行采集（約移栽后100 d）。參照Zhao等（2016）的根際土壤采集方 法，在每小區(qū)按發(fā)病重度、中度、輕度各采取4株完整 植株根際土壤。將采集的根際土壤混合均勻，分成 兩份，一份約2000 g室溫保存，用于土壤理化性質(zhì)測 定；一份約500 g放入無菌密封袋裝入冰盒，帶回實 驗室-80 ℃保存，用于細(xì)菌群落多樣性分析。

1. 3. 3 理化性質(zhì)測定方法

土壤pH采用pH計、全 磷采用鉬銻抗比色法、全氮采用半微量凱氏定氮法、 堿解氮采用堿解擴散法進(jìn)行測定（鮑士旦，1999）；土 壤速效磷和速效鉀分別采用碳酸氫鈉浸提鉬銻抗比 色法和乙酸銨浸提火焰光度法進(jìn)行測定（張甘霖和 龔子同，2012）；硝態(tài)氮和銨態(tài)氮采用流動注射分析 法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2. 1 生防菌XP1對香蕉枯萎病的防治效果

由表1可知，CK處理香蕉植株無發(fā)病現(xiàn)象；DI處 理在接種香蕉枯萎病菌GFP-FOC4后蕉園的發(fā)病率 高達(dá)95.0%，病情指數(shù)為68.3；TR處理接種生防菌 XP1后蕉園的發(fā)病率為13.3%，與DI處理相比差異達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同），病情指數(shù)降低至10.8， 防治效果顯著，達(dá)84.2%。TR處理香蕉枯萎病發(fā)病 率較DI處理降低81.7%（絕對值），說明生防菌對香蕉枯萎病菌具有較強的拮抗作用。

2. 2 Observed species指數(shù)分析結(jié)果

共測序獲得886890個序列，在97%的相似水平 下聚類后獲得61660個OTUs。測序結(jié)果顯示，3個樣品的所有優(yōu)質(zhì)序列經(jīng)聚類注釋后歸屬于40個菌門。 從圖1可看出，當(dāng)測序深度達(dá)80000個序列時，各處理 的Observed species指數(shù)曲線趨向平緩，上升速度減 緩，說明測序深度已基本覆蓋樣品中絕大部分物種； 在同等測序深度上，無發(fā)病現(xiàn)象的CK處理實際觀測 到的物種數(shù)最多，當(dāng)測序深度達(dá)70000個序列時，接 種致病菌的DI處理實際觀察到的物種數(shù)低于CK處 理、高于TR處理，隨測序深度的加大，接種生防菌的 TR處理其實際觀測到的物種數(shù)略高于DI處理、低于 CK處理。

3 討論

近年來，由于連作、施肥不當(dāng)和線蟲危害等導(dǎo)致的土傳病害越來越普遍，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大經(jīng) 濟損失。研究發(fā)現(xiàn)，土傳病害的發(fā)生主要與土壤微 生物群落結(jié)構(gòu)失衡、生態(tài)環(huán)境惡化等有關(guān)（van Bruggen and Semenov，2000）。生物防治是目前用于防 控香蕉枯萎病最受歡迎的一種綠色安全措施，其原 理是利用生防菌來抑制病原菌的繁殖和增長，從而 使土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)維持均衡。

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