骨質(zhì)疏松癥( osteoporosis，OP) 是一種以骨質(zhì)量 減少和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加 和骨折風(fēng)險(xiǎn)提高的代謝性骨病。當(dāng)前 OP 的治療主要以藥物為主，非藥物治療為輔。除了傳統(tǒng)的藥 物，研究者發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑( angiotensin-conversting enzyme inhibitors，ACEI) 類藥物同樣有改善骨質(zhì)疏松的作用。

小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞 MC3T3-E1 購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

α-MEM 完 全 培 養(yǎng) 基、胎 牛 血 清 ( FBS) 、0． 25% 胰蛋白酶溶液( 美國 Gibco 公司) ; 茜 素紅染液( 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%，pH 4． 2，廣州翔博生物公 司) ; 培哚普利·叔丁胺鹽( MCE 中國公司) ; DMSO ( 美國 Sigma 公司) ; 錐蟲藍(lán)( 廣州翔博生物公司) ; CCK-8 試劑盒( 日本同仁化學(xué)研究所) ; ALP 檢測試劑 盒、BCA 蛋白定量試劑盒、TritonX-100、β-甘油磷酸 鈉、抗壞血酸和地塞米松( 廣州翔博生物公司) 。

iMark 酶標(biāo)儀( 美國 BIO-ＲAD 公 司) ; Thermo FOＲMA 370 CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱( 美國密理博公司) ; BCM-1000A 生物潔凈工作臺(tái)( 中國蘇凈集團(tuán)蘇州安泰公司) ; 202A-1 型數(shù)顯電熱恒溫干燥 箱( 上海悅豐儀器儀表有限公司) ; OLYMPUSCK40 倒置顯微鏡( 日本 Olympus 公司) ; 可見光分光光度 計(jì) 722s( 上海棱光技術(shù)有限公司) ; TS-8 脫色搖床 ( 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司) ; 超低溫冰 箱( 美國 Forma 公司) 。

精確稱取 50 mg 抗壞血酸， 充分溶于10 mL ddH2O 中，用直徑為22 μm 的細(xì)針過 濾器過濾后，于 4℃冰箱中保存，每 100 mL 培養(yǎng)基中 加入該溶液 1 mL，使其質(zhì)量濃度為 50 mg·L － 1 。

精確稱取 2． 16 g β-甘 油磷酸鈉溶于10 mL ddH2O 中，用直徑為22 μm 的細(xì) 針過濾器過濾后，于 4℃冰箱中保存，每 100 mL 培養(yǎng) 基中加入該溶液 1 mL，使其濃度為 10 mmol·L － 1 。 1． 5 細(xì)胞鑒定 采用傳代細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)和建 立成骨細(xì)胞系 MC3T3-E1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并通過觀 察其生物形態(tài)及用茜素紅行鈣結(jié)節(jié)染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基本鑒定。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有 10% 胎牛血清的 α-MEM 完全培養(yǎng)基中，5% CO2 37℃孵箱中培養(yǎng)，待 細(xì)胞融合度達(dá) 90% 時(shí)，0． 25% 胰酶消化，按 1∶ 3 比 例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取生長良好的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度 后接種于 6 孔板中，每組培養(yǎng)基中均加入誘導(dǎo)液作 為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，設(shè)不加培哚普利的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為空 白對(duì)照組。培養(yǎng) 7 d 后，用 10% 甲醛室溫固定后，加 入茜素紅染液染色，37℃ 孵育，再用 PBS 孵育，去除 殘留染色液后顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況。

倒置顯微鏡下觀察，可見 MC3T3-E1 細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞呈長梭形，胞體豐滿，具有少量短的突觸，中央胞核呈橢圓形或圓形， 核仁清晰。培養(yǎng)至第 3 天，細(xì)胞長滿培養(yǎng) 瓶底，呈放射狀、漩渦狀排列，細(xì)胞間互相接觸外觀 似“馬賽克”樣。肉眼可見到細(xì)胞爬片上不均勻著 色，鏡下觀察到細(xì)胞基質(zhì)中有礦化結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)大 小、形態(tài)不一。第 7 天觀察時(shí)鏡下可見各組 細(xì)胞均有紅色的礦化結(jié)節(jié)形成，隨培養(yǎng)時(shí)間延長染 色面積增大，鈣結(jié)節(jié)密度增高; 第 14 天時(shí)結(jié)節(jié)輪廓 清晰，結(jié)節(jié)間距較大; 培養(yǎng)至 21 d 時(shí)結(jié)節(jié)面積增大， 有的結(jié)節(jié)邊界甚至超出視野。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和鈣結(jié) 節(jié)可初步鑒定該細(xì)胞為 MC3T3-E1 細(xì)胞。因此采用 傳代細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)建立成骨細(xì)胞系 MC3T3-E1 實(shí) 驗(yàn)細(xì)胞模型是成功的，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，48 h 時(shí) 1 ×10 － 5 和 1 ×10 － 6 mol· L － 1 有促細(xì)胞增殖的能力，提示此 2 種濃度的培哚普 利在足夠長時(shí)間的作用下可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，而 余濃度在實(shí)驗(yàn)的時(shí)間里均未有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用， 說明培哚普利促進(jìn) MC3T3-E1 細(xì)胞增殖的適宜濃度 為低濃度。目前的研究表明，MC3T3-E1 細(xì)胞能夠 產(chǎn)生 ACE，表面存在 AT1、AT2 受體，培哚普利可抑 制 ACE，但此作用對(duì)細(xì)胞增殖影響不大，猜測培哚 普利有可能通過激活 MC3T3-E1 細(xì)胞中與增殖相關(guān) 的信號(hào)通路如 wnt 通路、Noth 通路和 BMP-Smads 通 路或增殖相關(guān)基因如 c-myc、c-fos 和 c-jun 等，其機(jī)制 還需要更多的實(shí)驗(yàn)探討。本實(shí)驗(yàn)證明一定濃度的培 哚普利溶液具有促進(jìn)成骨前體細(xì)胞增殖的能力，與 文獻(xiàn)報(bào)道的 ACEI 另一種藥卡托普利作用于 MC3T3-E1 細(xì)胞相似，推測培哚普利可以通過促進(jìn)成骨前體細(xì)胞數(shù)量增加發(fā)揮其成骨作用，為骨形成 提供細(xì)胞基礎(chǔ)研究。



 

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