腦出血（ICH）是較為嚴(yán)重的一種急性腦血管疾 病，約占全部腦卒中的10%~17%。本病發(fā)病死亡率高，在北美，ICH患者發(fā)病30 d內(nèi)的死亡率約為44%， 僅有20%的患者預(yù)后良好。ICH患者的神經(jīng)功能損 傷一般較為嚴(yán)重，急性期多伴有頭痛、單側(cè)虛弱、嘔吐、 癲癇和意識(shí)障礙等癥狀，即便好轉(zhuǎn)之后常會(huì)遺留肢體 不遂，語(yǔ)言、感覺(jué)障礙等嚴(yán)重問(wèn)題。血液破入腦實(shí)質(zhì)或腦室，不僅直接損傷神經(jīng)系統(tǒng)，而且出血所觸發(fā)的炎癥 信號(hào)會(huì)引起促炎癥細(xì)胞因子如細(xì)胞間黏附分子-1 （ICAM-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)異常，從而 產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成神經(jīng)功能繼發(fā)性損傷。本實(shí) 驗(yàn)采用自體血注射所制備的大鼠ICH模型，以針刺水 溝、內(nèi)關(guān)為干預(yù)方法，觀察不同針刺施術(shù)時(shí)長(zhǎng)下ICH急 性期大鼠腦血腫周圍區(qū)域ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL6、HSP70含量的變化規(guī)律，從炎癥反應(yīng)與腦組織保護(hù) 角度，探究不同針刺量學(xué)條件下的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告 如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康的 SPF 級(jí) 8 周齡左右雄性 SD大鼠共40只，體質(zhì)量（300±25）g。實(shí)驗(yàn)大鼠由北京 維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn) 許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK （津）2014-0002。環(huán)境溫度20~25 ℃，晝夜規(guī)律飼養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器

小鼠單克隆抗體 ICAM-1（Abcam 公司，編號(hào) 171123）、小鼠單克隆抗體 TNF-α（Abcam 公司，編號(hào) 220210）、兔多克隆抗體 IL-1β（Abcam 公 司，編號(hào)9277）、小鼠單克隆抗體IL-6（Abcam公司，編 號(hào)9324）、小鼠單克隆抗體HSP-70（Abcam公司，編號(hào) 2787）；蘇木素、DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物 技術(shù)有限公司）；渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)其林貝爾QL-902）；恒溫水浴箱（江蘇太倉(cāng)醫(yī) 用儀器廠，型號(hào) DSHZ-300）；離心機(jī)（Eppendorf 公司， 型號(hào)5430）；石蠟切片機(jī)（萊卡公司，型號(hào)RM2015）；顯 微鏡（奧林巴斯公司，型號(hào)：BX51T-PHD-J11）；醫(yī)用X 射線膠片（柯達(dá)公司）；多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管 理系統(tǒng)（Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus）；針灸 針（華佗牌，規(guī)格0.25 mm×40 mm）。

1.3 分組與造模

采用 SPSS19.0 軟件系統(tǒng)產(chǎn)生隨機(jī) 數(shù)法將48只大鼠隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組、模型組、針 刺5 s組、針刺60 s組，每組10只。Sham組于術(shù)后次日 開始模擬針刺組的捉抓過(guò)程，每日1次；模型組于造模 成功后次日開始模擬針刺組的捉抓過(guò)程，每日1次；針 刺組于造模成功后次日開始針刺干預(yù)，每日1次。大 鼠在干預(yù)5 d后（假手術(shù)、造模后第6日）斷頭取腦，制 備石蠟切片和凍存樣品。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理 符合國(guó)際獸醫(yī)學(xué)編輯協(xié)會(huì)編纂的《關(guān)于動(dòng)物倫理與福 利的作者指南共識(shí)》。采用尾狀核自體血注入法制作 ICH 模型。大鼠經(jīng) 10%水合氯醛水溶液腹腔注射麻 醉，劑量為300 mg/kg，麻醉后剃除頭頂毛；斷尾取血并 將血擠入抗凝管內(nèi)，用微量注射器抽入微量注射器 （100 μL）中備用。俯臥位，固定其于大鼠腦立體定位儀，先固定耳間線，移頭部至正中，固定門齒于齒溝上， 調(diào)整腦定位儀，使門齒溝平面略低于耳間線平面；碘伏 溶液皮膚消毒后沿正中皮膚、肌肉剪開約1.5 cm縱向 切口，血管鉗分離，過(guò)氧化氫水溶液拭去顱骨骨膜，顯 露顱骨，暴露顱骨上的前囟和冠狀縫區(qū)域，此時(shí)大鼠尾 部正對(duì)實(shí)驗(yàn)者，以前囟為原點(diǎn)，在向前旁開2 mm，向右 旁開 3 mm 處，用直徑 1 mm 骨鉆鉆孔，孔直徑約為 1 mm，以不損傷腦組織，鉆尖下落空感為度；將定位儀 上的微量注射器針尖移至要注射的部位，緩慢進(jìn)針 5 mm，向尾狀核內(nèi)緩慢（7 mins）注入50 μL自體全血， 留針 10 mins 后將注射針緩慢退出，并用骨蠟封閉鉆 孔，縫合皮膚、肌肉并用碘伏溶液消毒防止創(chuàng)口感染； 置于溫度適宜處自然蘇醒，此過(guò)程應(yīng)保持大鼠自主呼 吸。麻醉蘇醒后，大鼠出現(xiàn)或不立即出現(xiàn)神經(jīng)功能缺 損癥狀，歸籠飼養(yǎng)，次日出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀， 認(rèn)為造模成功。Sham組模擬皮膚、顱骨創(chuàng)傷過(guò)程但不 刺入腦組織。

1.4 針刺方法

兩針刺組均選取大鼠“水溝”穴、雙側(cè) “內(nèi)關(guān)”穴，大鼠腧穴定位根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸 研究會(huì)編寫的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》中的“水溝”“內(nèi)關(guān)” 穴位置；水溝穴采用“雀啄”法，內(nèi)關(guān)穴采用捻轉(zhuǎn)瀉法； 針刺5 s組各穴施快頻率（3次/s）手法5 s，針刺60 s組 各穴施快頻率（3 次/s）手法 60 s，刺畢不留針，每日 1 次，共5次。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1）各組取5只大鼠麻醉，行4% 多聚甲醛內(nèi)固定術(shù)，打開胸腔暴露心臟，在右心耳剪開 小口，經(jīng)左心室插入導(dǎo)管至升主動(dòng)脈，顯露導(dǎo)管；注射 200 mL 0.9%氯化鈉注射液沖洗血液至心耳處流出清 水，肝臟顏色變淺；再經(jīng)150 mL 4%多聚甲醛灌注至肝 臟、四肢、尾部僵硬 。斷頭處死后，在冰板上迅速開顱 取腦，放置于4%多聚甲醛溶液中待測(cè)；每只取血腫區(qū) 及周圍腦組織約100 mg，制備免疫組化切片；
2）另取5 只大鼠，斷頭取腦，分離血腫區(qū)及周圍腦組織作蛋白質(zhì) 印跡法（Western blotting）分析腦血腫區(qū) HSP-70 蛋白 表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)腦血腫區(qū)ICAM-1、TNF-α、IL1β、IL-6含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資 料以（x±s）表示，樣本定量分析應(yīng)用單因素方差分析， 方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)使用Dunnett′-T3 檢 驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

假手術(shù)組ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞為生理性表 達(dá)；與假手術(shù)組比較，模型組、針刺5 s組、針刺60 s組 ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)；與模型組比較，針刺5 s組ICAM-1 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；針刺60 s組表達(dá)減少（P < 0.05）。假手術(shù)組IL-6陽(yáng)性細(xì)胞為生理水平表達(dá)； 與假手術(shù)組相比，模型組、針刺5 s組、針刺60 s組IL-6 表達(dá)增強(qiáng)；與模型組比較，針刺5 s組、針刺60 s組IL-6 表達(dá)減少（P < 0.05），且針刺 60 s 組降低更明顯（P < 0.05）。

3 討 論

ICH在中醫(yī)理論中可歸于“中風(fēng)”病范疇，中醫(yī)經(jīng) 典中也以“大厥”“薄厥”“仆擊”“風(fēng)痱”“偏枯”等名稱記述，病勢(shì)多較危急，本病病因正氣虧虛，情志、飲食、勞 倦內(nèi)傷，病機(jī)為氣血逆亂，血溢腦脈之外，產(chǎn)生風(fēng)、火、 痰、瘀等病理產(chǎn)物，以突然昏仆、口舌歪斜、半身不遂、 言語(yǔ)謇澀或失語(yǔ)等癥狀為主要臨床表現(xiàn)，有中經(jīng)絡(luò)、中 臟腑之分。針刺是 ICH 急性期臨床上廣泛應(yīng)用的療 法，其中研究較多的具體方法主要有醒腦開竅針?lè)ㄅc 頭皮針透刺法，本實(shí)驗(yàn)以醒腦開竅法為基礎(chǔ)，以醒腦開 竅主穴“水溝”“內(nèi)關(guān)”穴為干預(yù)腧穴，探究在不同手法 作用時(shí)長(zhǎng)下的大鼠腦組織炎癥反應(yīng)因子的含量變化。



 

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