腦出血(ICH)是較為嚴(yán)重的一種急性腦血管疾 病,約占全部腦卒中的10%~17%。本病發(fā)病死亡率高,在北美,ICH患者發(fā)病30 d內(nèi)的死亡率約為44%, 僅有20%的患者預(yù)后良好。ICH患者的神經(jīng)功能損 傷一般較為嚴(yán)重,急性期多伴有頭痛、單側(cè)虛弱、嘔吐、 癲癇和意識(shí)障礙等癥狀,即便好轉(zhuǎn)之后常會(huì)遺留肢體 不遂,語(yǔ)言、感覺(jué)障礙等嚴(yán)重問(wèn)題。血液破入腦實(shí)質(zhì)或腦室,不僅直接損傷神經(jīng)系統(tǒng),而且出血所觸發(fā)的炎癥 信號(hào)會(huì)引起促炎癥細(xì)胞因子如細(xì)胞間黏附分子-1 (ICAM-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)異常,從而 產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),造成神經(jīng)功能繼發(fā)性損傷。本實(shí) 驗(yàn)采用自體血注射所制備的大鼠ICH模型,以針刺水 溝、內(nèi)關(guān)為干預(yù)方法,觀察不同針刺施術(shù)時(shí)長(zhǎng)下ICH急 性期大鼠腦血腫周圍區(qū)域ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL6、HSP70含量的變化規(guī)律,從炎癥反應(yīng)與腦組織保護(hù) 角度,探究不同針刺量學(xué)條件下的作用機(jī)制?,F(xiàn)報(bào)告 如下。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用健康的 SPF 級(jí) 8 周齡左右雄性 SD大鼠共40只,體質(zhì)量(300±25)g。實(shí)驗(yàn)大鼠由北京 維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn) 許可證號(hào):SCXK(京)2016-0002。于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK (津)2014-0002。環(huán)境溫度20~25 ℃,晝夜規(guī)律飼養(yǎng)。
1.2 試藥與儀器
小鼠單克隆抗體 ICAM-1(Abcam 公司,編號(hào) 171123)、小鼠單克隆抗體 TNF-α(Abcam 公司,編號(hào) 220210)、兔多克隆抗體 IL-1β(Abcam 公 司,編號(hào)9277)、小鼠單克隆抗體IL-6(Abcam公司,編 號(hào)9324)、小鼠單克隆抗體HSP-70(Abcam公司,編號(hào) 2787);蘇木素、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物 技術(shù)有限公司);渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司,型號(hào)其林貝爾QL-902);恒溫水浴箱(江蘇太倉(cāng)醫(yī) 用儀器廠,型號(hào) DSHZ-300);離心機(jī)(Eppendorf 公司, 型號(hào)5430);石蠟切片機(jī)(萊卡公司,型號(hào)RM2015);顯 微鏡(奧林巴斯公司,型號(hào):BX51T-PHD-J11);醫(yī)用X 射線膠片(柯達(dá)公司);多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管 理系統(tǒng)(Media Cybernetics公司,Image-Pro Plus);針灸 針(華佗牌,規(guī)格0.25 mm×40 mm)。
1.3 分組與造模
采用 SPSS19.0 軟件系統(tǒng)產(chǎn)生隨機(jī) 數(shù)法將48只大鼠隨機(jī)分為4組,假手術(shù)組、模型組、針 刺5 s組、針刺60 s組,每組10只。Sham組于術(shù)后次日 開始模擬針刺組的捉抓過(guò)程,每日1次;模型組于造模 成功后次日開始模擬針刺組的捉抓過(guò)程,每日1次;針 刺組于造模成功后次日開始針刺干預(yù),每日1次。大 鼠在干預(yù)5 d后(假手術(shù)、造模后第6日)斷頭取腦,制 備石蠟切片和凍存樣品。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理 符合國(guó)際獸醫(yī)學(xué)編輯協(xié)會(huì)編纂的《關(guān)于動(dòng)物倫理與福 利的作者指南共識(shí)》。采用尾狀核自體血注入法制作 ICH 模型。大鼠經(jīng) 10%水合氯醛水溶液腹腔注射麻 醉,劑量為300 mg/kg,麻醉后剃除頭頂毛;斷尾取血并 將血擠入抗凝管內(nèi),用微量注射器抽入微量注射器 (100 μL)中備用。俯臥位,固定其于大鼠腦立體定位儀,先固定耳間線,移頭部至正中,固定門齒于齒溝上, 調(diào)整腦定位儀,使門齒溝平面略低于耳間線平面;碘伏 溶液皮膚消毒后沿正中皮膚、肌肉剪開約1.5 cm縱向 切口,血管鉗分離,過(guò)氧化氫水溶液拭去顱骨骨膜,顯 露顱骨,暴露顱骨上的前囟和冠狀縫區(qū)域,此時(shí)大鼠尾 部正對(duì)實(shí)驗(yàn)者,以前囟為原點(diǎn),在向前旁開2 mm,向右 旁開 3 mm 處,用直徑 1 mm 骨鉆鉆孔,孔直徑約為 1 mm,以不損傷腦組織,鉆尖下落空感為度;將定位儀 上的微量注射器針尖移至要注射的部位,緩慢進(jìn)針 5 mm,向尾狀核內(nèi)緩慢(7 mins)注入50 μL自體全血, 留針 10 mins 后將注射針緩慢退出,并用骨蠟封閉鉆 孔,縫合皮膚、肌肉并用碘伏溶液消毒防止創(chuàng)口感染; 置于溫度適宜處自然蘇醒,此過(guò)程應(yīng)保持大鼠自主呼 吸。麻醉蘇醒后,大鼠出現(xiàn)或不立即出現(xiàn)神經(jīng)功能缺 損癥狀,歸籠飼養(yǎng),次日出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀, 認(rèn)為造模成功。Sham組模擬皮膚、顱骨創(chuàng)傷過(guò)程但不 刺入腦組織。
1.4 針刺方法
兩針刺組均選取大鼠“水溝”穴、雙側(cè) “內(nèi)關(guān)”穴,大鼠腧穴定位根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸 研究會(huì)編寫的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》中的“水溝”“內(nèi)關(guān)” 穴位置;水溝穴采用“雀啄”法,內(nèi)關(guān)穴采用捻轉(zhuǎn)瀉法; 針刺5 s組各穴施快頻率(3次/s)手法5 s,針刺60 s組 各穴施快頻率(3 次/s)手法 60 s,刺畢不留針,每日 1 次,共5次。
1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)
1)各組取5只大鼠麻醉,行4% 多聚甲醛內(nèi)固定術(shù),打開胸腔暴露心臟,在右心耳剪開 小口,經(jīng)左心室插入導(dǎo)管至升主動(dòng)脈,顯露導(dǎo)管;注射 200 mL 0.9%氯化鈉注射液沖洗血液至心耳處流出清 水,肝臟顏色變淺;再經(jīng)150 mL 4%多聚甲醛灌注至肝 臟、四肢、尾部僵硬 。斷頭處死后,在冰板上迅速開顱 取腦,放置于4%多聚甲醛溶液中待測(cè);每只取血腫區(qū) 及周圍腦組織約100 mg,制備免疫組化切片;
2)另取5 只大鼠,斷頭取腦,分離血腫區(qū)及周圍腦組織作蛋白質(zhì) 印跡法(Western blotting)分析腦血腫區(qū) HSP-70 蛋白 表達(dá);免疫組化法檢測(cè)腦血腫區(qū)ICAM-1、TNF-α、IL1β、IL-6含量。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
應(yīng)用 SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資 料以(x±s)表示,樣本定量分析應(yīng)用單因素方差分析, 方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí)使用Dunnett′-T3 檢 驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
假手術(shù)組ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞為生理性表 達(dá);與假手術(shù)組比較,模型組、針刺5 s組、針刺60 s組 ICAM-1表達(dá)增強(qiáng);與模型組比較,針刺5 s組ICAM-1 表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05);針刺60 s組表達(dá)減少(P < 0.05)。假手術(shù)組IL-6陽(yáng)性細(xì)胞為生理水平表達(dá); 與假手術(shù)組相比,模型組、針刺5 s組、針刺60 s組IL-6 表達(dá)增強(qiáng);與模型組比較,針刺5 s組、針刺60 s組IL-6 表達(dá)減少(P < 0.05),且針刺 60 s 組降低更明顯(P < 0.05)。
3 討 論
ICH在中醫(yī)理論中可歸于“中風(fēng)”病范疇,中醫(yī)經(jīng) 典中也以“大厥”“薄厥”“仆擊”“風(fēng)痱”“偏枯”等名稱記述,病勢(shì)多較危急,本病病因正氣虧虛,情志、飲食、勞 倦內(nèi)傷,病機(jī)為氣血逆亂,血溢腦脈之外,產(chǎn)生風(fēng)、火、 痰、瘀等病理產(chǎn)物,以突然昏仆、口舌歪斜、半身不遂、 言語(yǔ)謇澀或失語(yǔ)等癥狀為主要臨床表現(xiàn),有中經(jīng)絡(luò)、中 臟腑之分。針刺是 ICH 急性期臨床上廣泛應(yīng)用的療 法,其中研究較多的具體方法主要有醒腦開竅針?lè)ㄅc 頭皮針透刺法,本實(shí)驗(yàn)以醒腦開竅法為基礎(chǔ),以醒腦開 竅主穴“水溝”“內(nèi)關(guān)”穴為干預(yù)腧穴,探究在不同手法 作用時(shí)長(zhǎng)下的大鼠腦組織炎癥反應(yīng)因子的含量變化。
免責(zé)聲明:文章僅供學(xué)習(xí)和交流,如涉及作品版權(quán)問(wèn)題需要我方刪除,請(qǐng)聯(lián)系我們,我們會(huì)在第一時(shí)間進(jìn)行處理。