乳酸菌作為一種重要的腸道微生物菌群在動(dòng)物 胃腸道內(nèi)發(fā)揮重要作用。大量研究顯示，乳酸菌在腸 道內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生大量乳酸、乙酸及其他揮發(fā)性 脂肪酸，從而調(diào)控動(dòng)物胃腸道內(nèi)的 pH 值，以提高鐵、 磷、鈣等多種微量元素的吸收和利用。除此之外， 乳酸菌可利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生大量有機(jī)酸，對(duì)維持動(dòng)物 胃腸道內(nèi)的微生物區(qū)系平衡和保護(hù)動(dòng)物消化機(jī)能具 有不容忽視的作用; 動(dòng)物胃腸道內(nèi)的乳酸菌群可對(duì)多 種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌產(chǎn)生明顯的抑制作 用，并激活巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞，從而增 強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

1 材料 

1. 1 樣品

成年牛瘤胃，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)與 技術(shù)學(xué)院提供。

1. 2 主要試劑

MＲS 固體/液體培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技 術(shù)有限責(zé)任公司; 乳酸菌生化鑒定管，購(gòu)自青島高科 技工業(yè)園海博生物科技有限公司。

1. 3 主要儀器

潔凈工作臺(tái)( 型號(hào)為 BCN－1360B) ，購(gòu)自哈爾濱 市東聯(lián)電子技術(shù)有限公司; 恒溫?fù)u床( 型號(hào)為 BSD－ YX3600) ，購(gòu)自上海旻泉儀器有限公司; 電子精密天 平( 型號(hào)為 JA2003N) ，購(gòu)自上海佑科儀器儀表有限 公司; 臺(tái)式離心機(jī)( 型號(hào)為 TDL－5－A) ，購(gòu)自上海飛 鴿儀器有限公司; 生物顯微鏡( 型號(hào)為 DM2500) ，購(gòu) 自北京悅昌行科技有限公司; 電熱恒溫培養(yǎng)箱( 型號(hào)為 DＲP－9082) ，購(gòu)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司; 超 低溫 冰 箱［型 號(hào) 為 MDF － 382E ( N) ］，購(gòu) 自 日 本 Hitachi 公司; 電熱恒溫水浴鍋( 型號(hào)為 HWS12) ，購(gòu) 自上海一恒科學(xué)儀器有限公司; 旋渦振蕩器( 型號(hào)為 其林貝爾QL－861) ，購(gòu)自海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司; 精密 pH 計(jì)( 型號(hào)為 PHS － 3C) ，購(gòu)自上海雷磁儀器 廠; 多 功 能 酶 標(biāo) 儀 ( 型 號(hào) 為 TECAN Infinite M200PＲO) ，購(gòu)自瑞士 Tecan 公司。

2 方法

2. 1 菌株的分離純化與形態(tài)觀察

從瘤胃內(nèi)層取樣，將樣品剪碎置無(wú)菌生理鹽水中， 離心獲取上清液。按照 1 ∶ 100 比例稀釋上清液，均勻 涂布于 MＲS 固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng) 24 h，挑取 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單個(gè)菌落，反復(fù)劃線分離至獲得純菌 株，將其命名為 Y－A－2。觀察菌落形態(tài)，并且進(jìn)行革 蘭氏染色，使用生物顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)及顏色。

2. 2 生化試驗(yàn)

采用直接接種法。從 MＲS 固體培養(yǎng)基中挑取已 純化培養(yǎng)的 Y－A－2 菌株接種于生化鑒定管中，用封 口膜封口。除 1%馬尿酸鈉的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間 為 37 ℃ 水浴 2 h 外，其他試劑七葉苷、纖維二糖、麥 芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳 糖均為 37 ℃培養(yǎng) 24 ～ 48 h。根據(jù)生化鑒定管的顏色 變化來(lái)判斷乳酸菌的發(fā)酵情況: 七葉苷，陽(yáng)性為黃色或 黑色，陰性為紫色或紫灰色; 纖維二糖、麥芽糖、甘露 醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳糖，陽(yáng)性為 黃色，陰性為紫色或紫灰色; 1%馬尿酸鈉，陽(yáng)性為深 紫色，陰性為淡紫色或無(wú)色。

2. 3 16S rＲNA 序列比對(duì)與分析

在形態(tài)分析和生化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，委托吉林省庫(kù)美 生物科技有限公司合成乳酸菌通用引物，序列為 27F 5' － AGAGTTTGATCMTGGCTCAG － 3' 和 1492Ｒ 5' － TACGGYTACCTTGTTACGACTT－3'，挑取已純化培養(yǎng) 的 Y－A－2 菌株接種于 MＲS 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增， 委托吉林省庫(kù)美生物科技有限公司對(duì)其進(jìn)行 16S rＲNA 序列檢測(cè)，將所得測(cè)序結(jié)果輸入 GenBank 中對(duì) 其進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

2. 4 生物學(xué)特性研究

2. 4. 1 最適溫度的測(cè)定

在 MＲS 液體培養(yǎng)基和振 蕩速度相同的情況下，挑取 Y－A－ 2 純菌株接種到 7 支試管中，然后分別于 16，23，30，37，44，51，58 ℃ 溫度條件下?lián)u床培養(yǎng) 24 h，測(cè)定其 OD600值并記錄，重 復(fù) 3 次。從 7 個(gè)溫度中選取最優(yōu)溫度采用二分法 ［( X±7) ，( X±3) ，( X±1) ℃，］進(jìn)行再次測(cè)量，直至得 到最適溫度并記錄，重復(fù) 3 次。

2. 4. 2 生長(zhǎng)曲線的繪制

挑取 Y－A－2 純菌株接種 到試管中，在最適溫度條件下，24 h 內(nèi)每隔 2 h 測(cè)定 該菌的 OD600值 1 次并記錄，重復(fù) 3 次。2. 4. 3 pH 值的測(cè)定 挑取 Y－A－2 純菌株接種到試 管中，在最適溫度條件下，24 h 內(nèi)每隔 2 h 測(cè)定該菌 的 pH 值 1 次并記錄，重復(fù) 3 次。 2. 4. 4 耐鹽性試驗(yàn)將 MＲS 液體培養(yǎng)基中的鹽濃 度分 別 調(diào) 節(jié) 至 1. 5%、3. 5%、5. 5%、7. 5%、9. 5%、 11. 5%，每支試管分裝 3 mL，每管接種菌液 120 μL， 37 ℃厭氧培養(yǎng) 24 h，記錄 OD600值，重復(fù) 3 次。 2. 4. 5 耐酸堿試驗(yàn) 將 MＲS 液體培養(yǎng)基的 pH 值調(diào) 節(jié) 至 1. 5，3. 5，5. 5，7. 5，9. 5，11. 5，每 支 試 管 分 裝 3 mL，每管接種菌液 120 μL，37 ℃ 厭氧培養(yǎng) 24 h，記 錄 OD600值，重復(fù) 3 次。 

3 結(jié)果與分析

用接種針從 MＲS 固體培養(yǎng)基上挑取已純化培養(yǎng) 的同一菌落接種于生化鑒定管中，置( 36 ± 1) ℃ 溫箱 中恒溫培養(yǎng) 36 h 后對(duì)比顏色得出結(jié)果。從糖發(fā)酵試 驗(yàn)中得知，該菌株可以發(fā)酵纖維二糖、水楊苷、菊糖。 生化試驗(yàn)結(jié)果。厭氧培養(yǎng) 24 h 后可見(jiàn)菌落分散，菌落呈圓形，中 等大小，凸起，濕潤(rùn)，邊緣整齊，直徑為( 3± 1) mm，菌 落正面為乳白色，背面為黃色。多 次重復(fù)劃線分離純化菌株，對(duì)純化后的菌株進(jìn)行革蘭 氏染色，可見(jiàn)該菌株為革蘭氏陽(yáng)性、菌體單獨(dú)排列或 以小群聚集生長(zhǎng)，菌體呈球狀。初 步判定此菌株為革蘭氏陽(yáng)性球菌。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從牛瘤胃中分離純化出 Y－A－2 菌株，對(duì) 該菌進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)和 16S rＲNA 序列 同源性分析鑒定，確定 Y－A－2 菌株為乳酸片球菌。 生物學(xué)特性研究結(jié)果顯示，Y－A－2 菌株的最適生長(zhǎng) 溫度為 26 ℃，相比于其他同種菌株，24 h 內(nèi)生長(zhǎng)較為 緩慢，具有一定的耐鹽能力，不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿。

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