卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一， 且致死率較高。美國國立癌癥研究院（NCI）調(diào)查 顯示，卵巢癌的致死率約占女性生殖系統(tǒng)腫瘤死亡率 的一半。目前，對卵巢癌的手術(shù)治療尚不十分成熟， 因為卵巢癌極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，雖然以鉑類藥物為主的化 療能在一定程度上彌補(bǔ)手術(shù)治療的局限，但由此引發(fā) 的化療耐藥問題已成為卵巢癌治療的難題。

1 材料與方法 

1.1 材料 

1.1.1 藥品與試劑 

虎杖苷購自上海阿拉丁生化 科技股份有限公司，批號 D1713186，純度 ≥ 98%； MTT 粉末和二甲基亞砜購自廣州賽國生物科技有 限責(zé)任公司；Annexin V-FITC 染色細(xì)胞凋亡檢測試 劑盒和 JC-1 試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有 限公司；所有一抗抗體均購自美國 Cell Signaling Technology 公司；順鉑和 Hoechst33258 染色液、 小鼠抗 β-actin、山羊抗兔 IgG、山羊抗小鼠 IgG 均 購自上海碧云天生物技術(shù)公司。 

1.1.2 細(xì)胞 

人卵巢癌細(xì)胞系 SKOV3 購于中國 科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。 

1.1.3 主要儀器 

311 型氣套二氧化碳培養(yǎng)箱購 自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；CKX41 倒 置顯微鏡購自日本 Olympus 公司；Spectra Max Plus 384 酶標(biāo)儀和 ImageXpress 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)購自 美國 Molecular Devices 公司；BD C6 流式細(xì)胞儀購自美國 BD 公司；TS-2000A 脫色搖床購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Mini-Protean@Tetra 電泳槽、Mini Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽和 ChemiDOCTM XRS+ 分子成像系統(tǒng)購自美國 Bio-Rad 公司。 

1.2 方法 

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 

將 SKOV3 細(xì)胞以適量濃度分 別接種于培養(yǎng)瓶中，分別加入含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5% CO2 及 95% 相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)生長， 每周傳代 2 ~ 3 次，用 0.25% 胰酶消化 2 ~ 3 min 傳代。 

1.2.2 MTT 法 

取對數(shù)生長期的 SKOV3 細(xì)胞， 0.25% 胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細(xì) 胞濃度為 5 × 104 個/ml，每孔接種 100 μl，培養(yǎng) 24 h。設(shè)置不同濃度的虎杖苷（10、20、40、60、 80、100 μmol/L）6 個劑量組，對照組為 RPMI1640 培養(yǎng)基；順鉑 5 μmol/L 與以上 6 個不同劑量的 虎杖苷聯(lián)合作用，對照組為順鉑（5 μmol/L）。每 組各設(shè) 3 個復(fù)孔，給藥后繼續(xù)培養(yǎng) 24 和 48 h。 每孔加 20 μl MTT 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。棄原液，每孔 加 150 μl DMSO，振蕩器振蕩 10 min，以 570 nm 為檢測波長，630 nm 為參照波長，用酶標(biāo)儀檢測 各孔的吸光度（A），按下列公式計算不同濃度藥 物作用后腫瘤細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）= （A 實驗組/A 對照組）× 100%。用同樣的方法設(shè)置 5 個 不同濃度的順鉑（1.5、3、6.25、12.5、25 μmol/L） 給藥組，對照組為 RPMI1640 培養(yǎng)基，給藥后繼 續(xù)培養(yǎng) 24 和 48 h，計算細(xì)胞存活率。 

1.2.3 單克隆形成實驗 

取對數(shù)生長期的 SKOV3 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為（4 ~ 5）× 102 個/ml， 每孔 2 ml 接種于 6 孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 至細(xì)胞貼壁，棄去原有的培養(yǎng)液，分別加入虎杖苷 10 μmol/L，虎杖苷 20 μmol/L，順鉑 2.5 μmol/L， 虎杖苷 10 μmol/L + 順鉑 2.5 μmol/L 以及虎杖苷 20 μmol/L + 順鉑 2.5 μmol/L，RPMI1640 培養(yǎng)基 組作為空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后撤去加藥的 培養(yǎng)基，換成正常的新鮮培養(yǎng)基放于 37 ℃、5 % CO2 孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，且每隔 2 ~ 3 天換液，并于 光學(xué)顯微鏡下觀察克隆的形成。大約 15 d 后，6 孔 板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng) 液，用每孔 1 ml 的 PBS 清洗 2 次，每孔加 1 ml 的 4% 多聚甲醛固定 30 min，棄去固定液，用 PBS 清洗 2 次。每孔加入 1 ml 結(jié)晶紫染色液染 色 20 min 左右，然后用 PBS 緩慢洗去染色液，置于空氣中干燥后拍照處理。 

1.2.4 Hoechst33258 觀察細(xì)胞核形態(tài) 

SKOV3 細(xì)胞 1 × l05 個/孔接種于 96 孔板，置于 37 ℃、 5% CO2 及飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h 后加入虎 杖苷 20 μmol/L 以及虎杖苷 20 μmol/L + 順鉑 5 μmol/L，同時設(shè)定終濃度 < 0.1%（v/v）的 DMSO 為溶劑對照組，作用 24 h 后，取出用 PBS 清洗 細(xì)胞 2 次，然后用 4% 多聚甲醛固定 30 min，用 PBS 清洗兩次，接著每孔加入 200 μl Hoechst33258 染液，終濃度為 5 μg/ml，37 ℃ 避光染色 30 min。 染色結(jié)束后用 ImageXpress 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)進(jìn)行 拍照。

2 結(jié)果 

2.1 虎杖苷與順鉑聯(lián)用對 SKOV3 細(xì)胞生長的影響

虎杖苷單獨用藥和 順鉑單獨用藥對卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞 24、48 h 的 細(xì)胞存活率比較所示；24 h 的虎杖苷、順鉑、虎杖苷+順鉑聯(lián)合組的 IC50 分別為（257.3 ± 5.9）、（14.4 ± 2.7）、（190.5 ± 7.3）μmol/L，CI50 = 1.08 ± 0.2，CI ≤ 1.1，為疊加作用；48 h 的虎杖苷、順 鉑、虎杖苷 + 順鉑聯(lián)合組的 IC50 分別為（175.7 ± 6.3）、（8.8 ± 2.1）、（13.8 ± 4.5）μmol/L，CI50 = 0.68 ± 0.14，CI < 0.8，為中度協(xié)同作用。結(jié)果 表明虎杖苷與順鉑聯(lián)合作用 48 h 對抑制 SKOV3 細(xì)胞生長有協(xié)同作用。 

2.2 單克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖抑制作 

顯示虎杖苷與順鉑聯(lián)合作用后對 SKOV3 細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)?；⒄溶諉为氉? 用卵巢癌細(xì)胞的抑制增殖作用不甚顯著，但當(dāng)其與 順鉑（2.5 μmol/L）聯(lián)用時，20 μmol/L 的虎杖苷明 顯抑制細(xì)胞增殖。

3 討論 

卵巢癌的化療耐藥及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是世界醫(yī)學(xué)界 待攻克的一大難題，需要研究新藥物和新的治療策 略來改善卵巢癌的預(yù)后。許多研究表明，中藥成分開發(fā)正在成為發(fā)現(xiàn)抗癌藥物的新方法。中藥虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc. 系蓼科植物，具 有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功 效。其核心成分是虎杖苷，在腫瘤治療方面具有較 高的藥用價值。我們的研究表明虎杖苷能增強(qiáng)卵 巢癌細(xì)胞對順鉑的藥物敏感性，兩者聯(lián)用具有協(xié)同 作用，能使細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。

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